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抗生素类之头孢菌素类药物中 8 种 N-亚硝胺类基因毒性杂质的测试方法

来源:本站      2023-11-28
导读:头孢菌素类药物是以天然头孢菌素 C作为原料,经过半合成改造其侧链而得到的一类抗菌药物,也是目前临床应用最广泛的一类 抗菌药物。头孢孟多酯钠和盐酸头孢替安属于第二 代头孢菌素类药物,对革兰阴性杆菌所产生的的 β- 内酰胺酶的稳定性较第一代头孢菌素强,临床上用 于呼吸系统、皮肤和软组

        头孢菌素类药物是以天然头孢菌素 C作为原料,经过半合成改造其侧链而得到的一类抗菌药物,也是目前临床应用最广泛的一类 抗菌药物。

头孢孟多酯钠和盐酸头孢替安属于第二 代头孢菌素类药物,对革兰阴性杆菌所产生的的 β- 内酰胺酶的稳定性较第一代头孢菌素强,临床上用 于呼吸系统、皮肤和软组织、骨和关节、泌尿系统等 感染,

头孢地嗪钠属于第三代头孢菌素,对革兰阳性 菌及革兰阴性菌具广谱抗菌作用,临床用于敏感菌 所致的下呼吸道、泌尿系感染。为了考察头孢孟多酯钠、盐酸头孢 替安、头孢地嗪钠原料药中是否含有常见的 N-亚硝 胺类基因毒性杂质,

保障药品的质量安全,建立了一个 GC-MS /MS 同时测定头孢 孟多酯钠、盐酸头孢替安、头孢地嗪钠中 8 种常见的 N-亚硝胺类基因毒性杂质的方法,与样品直接溶解 后进样的方法相比,对仪器污染少,干扰小,

可用于监测和控制这 3 种头孢菌素类药物中 N-亚硝胺类 基因毒性杂质。

1 仪器与试剂 

1.1 仪器 GC-MS/MS气质联用仪( 美国安捷伦 公司,配备液体自动进样器) ,CPA2250 型电子天平 ( 梅特勒-托利多公司) ,Vortex-3 型涡旋混合器( 德 国 IKA 公司) 。

1.2 试药 N-亚硝基二甲胺( NDMA) 对照品( 批号: PLSBI,99.9%) ,N-亚硝基二乙胺( NDEA) 对照品( SIGMA,批号: 049K1613,100%) ,N-亚硝基二丙胺( NDPA) 对照品( TCI,批号: 049K1613,100%) ,N-亚硝基 二 丁 胺 ( NDBA) 对 照 品 ( TCI,批 号: S47KJ-IT, 97.0%) ,N-亚硝基甲基乙基胺 ( NMEA) 对 照 品 ( CHEM SERVICE,批号: 8309900,99.5%) ,N-亚硝 基 吡 咯 烷 ( NPYR ) 对 照 品 ( SIGMA,批 号: MKCB3427,99%) ,N-亚 硝 基 哌 啶 ( NPIP ) 对 照 品 ( CHEM SERVICE,批号: 7377900,99.5%) ,N-亚硝 基吗 啉 ( NMOR) 对 照 品 ( TCI,批 号: MBSPF-GB,99.0%) 甲醇为色谱纯,氢氧化钠、二氯甲烷均为分 析纯。头孢孟多酯钠样品( XXX股份有限公司,批号: 2007101、2007102、2007103) 、盐酸头孢替安( XXX股份有限公司,批号: 2007110、 2007111、2007112) 、头孢地嗪钠(XXX股份有限公司,批号: 2002101、2002102、2002103) 。

2 方法与结果

2.1 仪器条件

2.1.1 GC 条件 色谱柱: Agilent VF-WAX ms( 30 m× 0.25 mm,0.25 μm) ,

  进样口温度: 250℃,

   脉冲不分流 进样;  

   程序升温条件: 50℃,保 持 1 min,以 15℃ · min-1 的速率升温至 100℃,保持 1.5min,再以 5℃ · min-1 的速率升温至 115℃,保持 1min,在以 20℃ · min-1 的速率升温至 200℃,保持 2 min,后运行

230℃, 保持 4 min; 流速: 1.0 ml·min-1

2.1.2 MS 条件 采用 EI 源,电压为 70 eV,接口温 度 280℃,离子源温度 250℃,四极杆温度 150℃,溶 剂延迟 5 min,MRM 模式,检测离子见表 1。

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2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品储备液 精密称取 NDMA、NMEA、 NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、NMOR 各适量,分 别加甲醇溶解并稀释制成浓度分别为 1.0670, 1.0310,1.0530,1.0170,0.9970,1.0930,1.0290 mg ·ml-1的溶液。

混合对照品储备液 A: 精密量取上述 8 个杂质单标溶液各0.5 ml置同一 50 ml 量瓶中,加甲 醇稀释至刻度摇匀。在精密量取0.5 ml置10 ml量瓶 中,加0.1 mol·L-1 的氢氧化钠溶液稀释至刻度,摇 匀。

混合对照品储备液 B: 精密量取1 ml混合对照品 储备液 A 置10 ml 量瓶中,0.1 mol·L-1 的氢氧化钠溶 液稀释至刻度,摇匀。 

2.2.2 对照品溶液 精密量取混合对照品储备液 B 15,60,150 μl,混合对照品储备液 A 30,60,150,300 μl,分别置 15 ml 刻度离心管中,各加0.1 mol·L-1 氢 氧化钠溶液稀释至 5 ml,混匀,

得到溶液的浓度分别 约为0.15,0.6,1.5,3,6,15,30 ng·ml -1 。于这些离心管分别精密加入 2 ml 二氯甲烷,涡旋混合 2 min,静置分层,取下层溶液作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 精密称取样品约0.25 g置15 ml 离心管中,加入0.1 mol·L-1 氢氧化钠溶液适量,涡 旋使样品完全溶解,再加氢氧化钠溶液至5 ml,混 匀,精密加入 2 ml 二氯甲烷,涡旋 2 min,静置分层, 取下层溶液作为供试品溶液。

2.3 测定方法学验证 

2.3.1 专属性试验 精密量取混合对照品储备液 A 30 μl,按“2.2.2”项下方法制备 3 ng·ml -1 的对照品 溶液; 精密称取头孢孟多酯钠、盐酸头孢替安、头孢 地嗪钠各0.25 g样品,分别置于 15 ml 刻度离心管 中,

精密加入混合储备对照品溶液 A 30 μl,按照 “2.2.3”项下方法溶解并萃取制备得到样品加标溶 液; 取0.1 mol·L-1 氢氧化钠溶液 5 ml,同法制备得 到空白溶液。取上述空白溶液、样品加标溶液及对 照品溶液、供试品溶液分别进样测定,

记录的 TIC 色 谱图见图 1,结果空白溶液无干扰,3 种样品溶液中 也无杂质干扰,8 个亚硝胺杂质分离良好,峰型好, 满足系统适用性的要求。

2.3.2 进样重复性 取“2.3.1”项下的对照品溶液 连续进样 6 针,记录 8 个杂质峰定量离子的峰面积, 计 算 NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、 NPYR、NMOR 的 峰 面 积 RSD 分 别 为2.4%,1.9%, 2.5%,2.1%,2.0%,2.7%,2.5%,2.5% ( n = 6) ,表明 进样重复性良好。 

2.3.3 线性关系考察 取“2.2”项下线性对照品溶 液分别进样测定,记录 8 个杂质峰定量离子的峰面 积,分别 以 峰 面 积 A 为 纵 坐 标,以 浓 度 ( C,ng · ml -1 ) 为横坐标,得到回归方程和相关系数。结果见 表 2。表明 8 个亚硝胺杂质在各自的浓度范围内线 性关系良好。

2.3.4 定量限和检出限 取混合对照品储备液 B 采用0.1 mol·L-1 氢氧化钠溶液逐级稀释,再精密量 取 5 ml 分别加入到约0.25 g样品中,按 2.2 项下方 法制备得到供试品溶液分别进样测定,当被测峰的 S /N 达到 10 左右时测得

NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、NMOR 的最低定量浓度分 别为0.16,0.15,0.16,0.16,0.15,0.10,0.16,0.11 ng· ml -1 ,

即定量限分别为 0.0032,0.0030,0.0031, 0.0032,0.0031,

0.0021,0.0033,0.0022 μg·g-1 ; 当被测 峰 的 S /N 达 到 2 ~ 3 左 右 时 测 得 NDMA、 NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、NMOR 的最低检出浓度为0.053,0.050,0.052,0.053,0.051, 0.031,

0.055,0.033 ng·ml -1 即检出限为0.00110.00100.00100.00110.00100.00060.00110.0007 μg·g-1

2.3.5 精密度试验 精密称取头孢孟多酯钠样品 ( 批号: 2007101) 、盐酸头孢替安( 批号: 2007112) 、 头孢地嗪钠样品( 批号: 2002103) 各 6 份,约0.25 g, 按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备得到溶液分 别进样测

定,结果 8 个亚硝胺杂质均未检出另精 密称取上述 3 个样品 6 0.25 g分别精密加入 30 μl 混合对照品储备液 A2.2项下方法制备 得到供试品溶液分别进样测定结果头孢孟多酯钠 NDMA

NMEANDEANDPANDBANPIPNPYRNMOR 的 含 量 RSD 分 别 为 1.4%2.1%1.8%2.6%3.1%1.9%3.5%2.3%; 盐酸头孢替安 NDMANMEANDEANDPANDBANPIP

NPYRNMOR 的 含 量 RSD 分 别为 3.5%,2.7%,2.3%3.2%4.2%2.7%2.4%3.4%; 头孢地嗪钠中 NDMANMEANDEANDPANDBANPIPNPYRNMOR 的含量 RSD 

分别为3.5%3.0%3.9%3.3%3.2%3.5%3.7%3.1%( n = 6)

2.3.6 回收率试验 精密称取头孢孟多酯钠样品 ( 批号: 2007101) 、盐酸头孢替安( 批号: 2007112) 、 头孢 地 嗪 钠 样 品 ( 批 号 为 2002103 ) 各 9 份,约 0.25 g,其中 3 份分别精密加入 60 μl 混合对照品储 备液 B,

3 份分别精密加入 30 μl 混合对照品储备液 A,3 份分别精密加入 150 μl 混合对照品储备液 A, 按“2.2”项下供试品溶液制备方法制备得到低、中、 高回收率测试溶液 ( 分 别 相 当 于 0.012,0.06, 0.3 μg·g-1

浓度水平) ,分别进样测定记录色谱图 与峰面积计算 8 个亚硝胺杂质的回收率结果在 高浓度的平均回收率均在85.5% ~ 110% RSD 4.8%( n = 9) 2.4 样品含量测定 取头孢孟多酯钠样

( 批号: 20076101、2007102、2007103) 盐酸头孢替安样品 ( 批 号: 200711020071112007112 ) 头孢地嗪钠样品 ( 批 号: 200210120021022002103) ,2.2项下的方法制 备供试品溶液分别进样测定

按标准曲线法以峰面积计算结果上述样品各 3 批均未检出 8 种亚硝胺杂质

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3 讨论

3.1 测定方法的选择 8 个 N-亚硝胺杂质的沸点在 157 ~ 237℃ 之间, 沸点较高,如采用顶空进样法即使采用较高的加热温度,各物质的灵敏度仍然较低,难以达到痕量检测的灵敏度要求,因此没有选择顶空法进行测定。

头孢孟多酯钠、盐酸头孢替安、头孢地嗪钠均易溶于水、氢氧化钠溶液,其它常见溶剂均无法同时溶解 3 种样品,然而水并不是一种好的气相色谱用溶剂,相 对于其他有机溶剂的灵敏度低,峰型差,

如采用水溶 液直接溶解上述样品后进样检测,水进入气相色谱 仪后还会对色谱系统造成损害,此外高浓度的样品 溶液多次进样之后容易污染进样口的衬管和色谱 柱,缩短色谱柱的寿命,样品在进样口高温状态

下可能降解产生某些杂质导致一些偶然误差的出现此本文没有采用直接溶解进样的方法

从实验中,采用从水溶液萃取测定 NDMA 和 NDEA 时,二氯甲烷是最理想的萃取剂,经试验发 现,8 种亚硝胺杂质均易溶于二氯甲烷,当采用二氯 甲烷去萃取含 8 种亚硝胺杂质的水溶液时,萃取效果较为理

想,而头孢孟多酯钠盐酸头孢替安头孢 地嗪钠均不易溶于二氯甲烷因此尝试采用萃取法 进行测定。 

3.2 供试品溶液制备方法的确定根据文献,NDMA 在碱性水溶液中采用有机 溶剂的提取率较高,因此尝试采用不同浓度的氢氧化钠溶液来溶解样品。取头孢孟多酯钠、盐酸头孢 替安、头孢地嗪钠样品0.25 g分别

采用1.0,0.5,0.2,0.1 mol·L-1 氢氧化钠溶液 5 ml 在常温下进行溶解 性试验,结果表明,不同浓度的氢氧化钠溶液均能够 完全溶解头孢孟多酯钠、盐酸头孢替安、头孢地嗪钠 3 种样品,1 mol·L-1 氢氧

化钠溶液溶解时溶液颜色呈黄色,当0.1 mol·L-1 氢氧化钠溶液溶解时溶液颜 色呈淡黄或浅黄色,氢氧化钠溶液的浓度越高溶液 的颜色越深,表明碱浓度过高易造成药物成分降解, 为了避免药物降解产生杂质

干扰,选择0.1 mol·L-1 氢氧化钠溶液来溶解样品。 

最终选择的条件是,取0.25 g样品,加入0.1 mol ·L-1 氢氧化钠溶液适量,涡旋使完全溶解,稀释至 5 ml,混匀,精密加入 2 ml 二氯甲烷,涡旋混合 2 min, 静置分层,取下层溶液作为供试品溶液。

3.3 本文检测的 8 种 N-亚硝胺类杂质中 NDMA 和 NDEA 被世界卫生组织的致癌物清单列为 2A 类致 癌物质,NMEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、NMOR 被列为 2B 类致癌物质。

根据国家药品监督管理局药审中心发布的《化学药物中亚硝胺类杂质研究技 术指导原则( 试行) 》的要求,为了保证药品的安 全,药品上市许可持有人/药品生产企业应对药品的 安全和质量进行生命周期管理,

尽可能避免亚硝胺 类杂质的引入,若确不能完全避免,应充分评估风 险,并将亚硝胺类杂质水平控制在安全限度以下。 关于亚硝胺类杂质产生的原因,根据指导原则有多 种产生原因,可能是工艺步骤中使用了

能引入仲胺和亚硝基化试剂的物料,可能是生产过程中使用 了被亚硝胺杂质污染的物料,也可能是药物降解产 生( 如雷尼替丁) 。此外文献[7]也显示,药物中 NDMA 和 NDEA 的来源可能是生产过程中原料、

中间 体或有机溶剂( 例如生产缬沙坦使用的 N,N-二甲基 甲酰胺) 中含有的微量二甲胺或二乙胺和亚硝酸盐 在酸性条件下反应产生头孢孟多酯钠盐酸头孢 替安和头孢地嗪钠均为半合成头孢菌素药物其中

头孢孟多酯钠和盐酸头孢替安都含有四氮唑结构头孢地嗪钠也含有氮杂环使用的物料可能会引入 容易产生亚硝胺类物质的成分或被亚硝胺杂质污 染,因此有必要对 N 亚硝胺类杂质进行筛查和质量 控制。

 本方法中 NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、 NPIP、NPYR、NMOR 等 8 种亚硝胺杂质的定量限均达到0.003 3 μg·g-1 及以下灵敏度能够满足杂质 控制的限量要求本方法灵敏度高回收率均符合

要求方法简便可靠能够控制 3 种头孢类药物中 8 种亚硝胺类杂质的限量



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本文最后更新于2023-11-28 10:00:30,如果你的问题还没有解决,可以加入交流群和群友们一起讨论。