最近几年，LC/MS越来越普及，以前的标准缓冲盐（如磷酸盐缓冲液）已不再受欢迎。主要原因是，人们希望使用易挥发的流动相添加剂。磷酸盐不易挥发，而且随着时间的推移会堵塞 LC/MS接口。这将导致大量的停机时间。更重要的是，还需要大量的工作来重新清理接口。一些新的离子源设计可以在较长的时间内容纳高达 10 mM 的磷酸盐缓冲液，但仍然需要定期清洁。

因此，最简单的添加剂是单酸，如甲酸或乙酸。它们的使用浓度通常在 0.1% 到 1% 之间。这就提供了一个酸性环境，足以使碱性分析物完全质子化。在许多情况下，这足以很好地控制酸性和碱性分析物的保留。

不过，这种方法也有其局限性。强酸性流动相环境的缺点之一是会抑制酸性分析物的电离。因此，更好的质谱检测条件是在负离子模式下使用稍高的 pH 值进行检测。在这种情况下，需要使用乙酸铵和甲酸铵缓冲液，pH 值的控制对于控制保留非常重要。甲酸的 pKa 为 3.75，乙酸的 pKa 为 4.75。因此，这是此类缓冲盐的最佳 pH值。缓冲盐的典型浓度约为 20 mM或更低，甚至可能低至 5 mM。在如此低的缓冲液浓度下，缓冲液的pH值最好与缓冲离子的pKa 非常接近。对于如此低浓度的缓冲盐，一个合理的经验法则是使用与缓冲液 pKa相近的±1个 pH 单位的缓冲盐。

正确选择 pH 值可以避免的另一个问题——基质对分析物产生的离子抑制。这是 LC/MS 分析血浆样品的常见问题。然而，大多数基质干扰都是离子性或可电离性的，而相关分析物通常也是离子性的。因此，可以通过改变流动相的 pH 值来改变共洗脱模式。只要适当改变分析物和干扰物的洗脱模式，就能避免离子抑制。

有时可能需要在碱性 pH 下进行色谱分析。这样做的原因可能是：为了避免离子抑制，或者是希望通过改善相关分析物的离子化效率来提高灵敏度。酸性分析物在碱性 pH值范围内的质谱响应最好。另一方面，我们发现即使是碱性分析物，在碱性条件下也会有令人惊讶的反应。我们用于弱碱性流动相的添加剂是碳酸氢铵。缓冲盐成分的 pKa 值为 9.2 和 10.2。因此，碳酸氢铵可在广泛的碱性 pH 值范围内使用，最理想的值为 pH 值10。这种缓冲液与 MS 完全兼容。加热后，碳酸氢铵只分解成挥发性成分：氨、水和二氧化碳。

总而言之：不管是酸性范围（pH值为3到5）还是碱性范围（pH值为8.5到10），我们都有相应的解决方案，且与MS兼容。

乙酸铵盐如何？我看到它在中性 pH 值下使用。我也看到过这种情况。但是，我们必须认识到，它根本不是一种缓冲盐。在 pH 值为 7 时，乙酸铵没有任何缓冲能力。我们应该把它看作只是一种盐添加剂。它可能有助于质谱电离过程，但在分离过程中作用不大。对于中性 pH 值范围，最佳解决方案是先加入碳酸氢铵，然后再加入甲酸。实际的缓冲作用是由碳酸根离子的第一次解离提供的。在高浓度下，碳酸解离生成二氧化碳和水。但在 LC-MS 使用的低浓度缓冲液中，这是一种功能性方法且气泡也没有产生。

用于反相色谱的碱性缓冲盐

1、在过去几年中，出现了在碱性 pH 值范围内稳定的反相填料。我想了解一下这些新功能。在碱性pH 值范围内，反相色谱柱可以使用哪些缓冲液？

的确，对更广泛 pH 值范围的探索开辟了过去无法实现的新功能。如果选择侵蚀性较低的缓冲液，即使是传统的填料也可以在碱性 pH 范围内使用。

2、哪些缓冲盐更应避免？

答: 很明显，磷酸盐在碱性 pH 值范围内比其他缓冲剂更具侵蚀性。因此，我不建议将碱性磷酸盐缓冲液与硅胶填料或无机-有机混合填料一起使用。磷酸盐的 pH 值范围有限。氨也具有相当的侵蚀性 ，但可以用有机胺替代。此外，有机胺的 pH 值范围很广，pKa 值从 9 到 11.5 不等。

3、好的，那么建议使用哪些缓冲盐？

答：我们收集了三个表[1]中适合碱性 pH 值范围的缓冲剂。表 1 包含无机缓冲剂、表 2 有机缓冲剂和表 3 两性缓冲剂，因为它们常用于生化应用。其中一些缓冲剂也可用作流动相添加剂，正如甲酸和乙酸可用于酸性 pH 范围一样。流动相添加剂可用于控制分析物在 pKa 附近 ± 2 个pH 单位以外的电离。但是，如果分析物的 pKa 和流动相添加剂的pKa 处于相同的 pH 值范围内，则对保留或峰形的控制效果可能不如真正的缓冲剂。在无机缓冲盐中，碳酸氢铵是一个非常不错的选择，原因有很多。首先，由于碳酸根离子和铵离子的综合缓冲能力，它的 pH 值范围很广。在此外，它还与 MS 检测兼容，因为它会分解成挥发性成分。虽然它在低紫外范围内的本底较小，但在酸性范围内，其吸光度与甲酸、乙酸或反式脂肪酸的本底差不多。虽然这并不完美，但只要流动相的成分匹配良好，即使在低紫外范围的梯度中也可以使用。

表1. 无机缓冲盐

表2 有机缓冲盐

表3. 两性缓冲盐

在有机碱中（表 2），有几种可供选择的 pKa 值范围很广，从三甲胺的 9.7 到吡咯烷的 11.3。三甲胺的沸点很低，与 MS 检测兼容。当然，您需要使用与质谱兼容的反离子，如甲酸盐，或者您也可以将三甲胺仅用作流动相添加剂，就像在酸性 pH 范围内使用甲酸或醋酸一样。我们已经成功地将 pH 值为 11.5 的吡咯烷缓冲液与XTerra® 反相色谱柱一起长期使用 [3]。三乙胺是反相缓冲液的传统添加剂，用于抑制碱性分析物的拖尾。由于其气味难闻，人们尽量避免使用。异味是碱的一个普遍缺点。不过，也有一种解决方法：表 3 所示的两性缓冲盐。它们不易挥发，因此没有气味。另一方面，这也使得它们不再与 MS 系统兼容。

不过，如果您的方法永远不会使用质谱仪，那么两性缓冲盐可能是一个非常好的选择。它们在生物化学中应用广泛，而且纯度很高。表 3 中的 pK 值从 6 到 10.5。在本文讨论的所有 pH 值范围内，都有一种合适的缓冲盐。