2、对于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护？为什么要这样做？

答：新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。

如果要加快平衡时间，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。

3、氨基柱在进酸性样品时，很伤柱子，如使用一段时间后，柱效降低，峰形改变，如何恢复？

答：氨基柱测酸性样品，应该是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。建议：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨），之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1％。

4、色谱柱的技术都有哪些？比如封尾等，这些技术在应用时都体现在哪里？

答：色谱柱技术包括填料技术和装柱技术，填料技术自不待言，填料的好坏对色谱柱分离性能和选择性有决定性影响。装柱技术也没有想象中的这么简单，不同固定相、不同粒径、不同柱管内径和长度，装柱工艺都有所不同，要装出紧密、稳定、均一的柱床，更多是一门艺术，需要经验积累。

国内和国外想比，我认为色谱柱的差距在于：国内公司以前都不会自己开发填料，一般买国外现成填料装柱，买到的填料质量控制权不在自己手里。另外因为装柱历史短，经验积累少，装柱工艺也没有完全达到国外水平。另外，对色谱柱性能很关键的基础材料-----裸硅胶，国产的还不过关，在纯度、粒径和孔径的均一性方面和国外产品相比，差距很大。

5、如果柱子取下来放置一段时间，需要做什么保护吗？

答：对一般的反相柱，也就是洗干净后放到纯甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然后用堵头塞紧柱两头，以免保存溶剂挥发，应该不需要做特殊的保护。

6、流动相中加入适量的四氢呋喃可以改善峰形的机理是什么？

答：《高效液相色谱方法及应用》于世林编著的上面说：甲醇为质子给予体、乙腈为质子接受体、四氢呋喃是偶极溶剂，应该除了极性影响，还有另外的影响因素，至于分离机理，还是比较复杂的，不能看成是个万能方法。

7、预柱或保护柱用还是不用的问题！原来分析中药品种时，我一直都是用保护柱。但来到新公司后，发现大家都没有使用，几个实验室连保护柱都没找到一个，也就是说大家从来都没有用过。后来问一个老员工，说是有可能影响药品分析。我就想问：安装保护柱后会影响样品分析吗？我们做的大多是头孢类的抗生素。

答：应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞，肯定有害于分离度和柱效，因为保护柱中间有着死体积的存在但是如果保护柱接得好，并且尽量控制其匹配性和经常更换，分离度和柱效应该影响并不大。

头孢类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂喽，有些原料药，可以根据色谱柱的损耗选择添加预柱（中间是个筛板），制剂的话，如果有辅料严重干扰或者流动相盐分比较大，那还是最好配个保护柱。

8、用的是四元梯度泵  A50%甲醇  B50%水  经常出现停或进气泡这是什么原因？

答：水/甲醇比例在55：45时，黏度和柱压有个极大值。50：50接近了这个极值，柱压是比较高的，但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径，你这个实例中不知用的什么规格的色谱柱？系统压力高，可能会因溶剂泵中的过滤头供液速度跟不上而导致气泡进入系统，停机也应该是因为气泡进入压力下降的原因，可考虑更换液体通量更大的过滤头。

9、填料方法的前三种都是湿法吗，能不能对四种填充方法做一个简短的说明？

资料显示：在正常条件下，填料粒度＞20µm时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20µm时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种①高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，Waters专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法。柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。为什么以20um为分界点？

10、我在做多肽药物时遇到下列问题：1）. 基线不稳定波动大，流动相  A  ：1％TFA水溶液  B:1％TFA乙腈溶液检测波长210nm  流速1.0ml/ml  什么原因？怎么解决？TFA有什么作用？流动相中不加TFA见不到主峰，基线良好。2）做完肽类样品时怎么冲洗C18比较好；3）药典上介绍测定分子量大于2000的样品，选择柱子填料的孔径为30nm，30nm与10nm对结果有什么区别？

答：应该是起“离子对”的作用吧。在做多肽类样品的时候，300A孔径的填料相对100A孔径肯定要选择性好点，也就是分离度相对比较好点。流动相加入TFA，在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段。流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。

三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于 200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。

11、waters  AtlantisC18柱可以用较高比例的流动相，那麽用完后应该怎麽清洗？在什麽体系中保存比教合适？

答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗维护：
流动相中不含缓冲盐       
分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min
流动相中含有缓冲盐       
分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向冲洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易长菌，使用时间不可超过3天）；
水性柱保存体系也不特别：短期保存在所用的流动相中（不含缓冲盐），中长期保存在纯甲醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中。

12、正相硅胶柱一般保存在什么溶剂里面比较合适？

答：短期和长期都建议保存在正相测定所用的流动相中，一般是正己烷和极少量的异丙醇。

13、磷酸盐缓冲盐渗透力强，为什么，是因为与醋酸盐，枸椽酸盐相比，基团小吗，使用磷酸盐缓冲液与其它缓冲液相比，会使色谱柱寿命缩短多少？

答：经常用磷酸盐，在其它条件差不多一样的情况下，柱子寿命肯定比不用磷酸缓冲盐相对短一些。但用磷酸盐也有不可取代的优点吧，否则不可能现在大部分人还在用。

14、反相离子对色谱法中，离子对是如何起作用的，是离子对试剂的非极性端溶解在填料的非极性端里，解离端伸向流动相，对含胺化合起离子交换作用，还是样品与离子对生成紧密的结合物，离子对试剂掩藏化合物中的极性基团，还是这种结合物是在解离与结合的动态平衡之中？

答：首先离子对试剂的解离端和目标离子形成离子缔合物，降低其极性，这样就能较好的在柱子上保留。再者，根据疏水效应理论，离子对试剂的疏水端是很容易和C18链相互作用的，这样更容易在柱子上保留，所以我认为离子对试剂作用是混合保留机制，即纯粹的反相保留和离子对保留机制共同作用。

15、四烷基季铵盐（如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等）在水中电离后，也形成了类似N＋H(CH2CH3)3的结构N＋(CH2CH2CH2CH3)4，这种结构也能有效的与Si－O－产生较强的静电作用，此类离子对用的比较少，但它的作用仅是掩藏Si－O－吗，它对物质的保留性能有何影响，实验中发现检测胺化物时，流动相中加入磷酸缓冲盐有增加物质保留的趋势，而加入三乙胺则会降低物质的保留能力？

16、HPLC柱前衍生和柱后衍生的相关问题？1）为什么要衍生？2）衍生化的分类？3）进行衍生，适用的化合物有哪些？4）进行衍生化的要求有哪些？5）柱前衍生和柱后衍生的优缺点？

答：色谱技术中的化学衍生法系指在色谱过程中用特殊的化学试剂（一般称为衍生化试剂或标记试剂）使样品成分转变相应的衍生物之后进行分离检测或进行检测的方法。目的为：1．将紫外—可见强吸收功能基团引入被检测对象或将其转变为荧光衍生物，以提高检测灵敏度；2提高对分析样品的分离和选择性。

从是否与HPLC系统联机的角度，化学衍生法分为在线on line）与离线∣Off line）两种。从发生衍生化的场合，分为柱前衍生法pre-columnderivatization）与柱后衍生法（post-columnderivatization）两种。目前，在HPLC中，以离线的柱前衍生法（简称柱前衍生法）与在线的柱后衍生法（简称柱后衍生法）使用居多。

17、多个样品不好不离的时候，请问该怎么通过选择合适的柱子来提高分离度？

答：提高分离度可从三个主要影响因素来考虑，柱效、选择性和保留因子。可通过减小填料粒径和增加柱长提高柱效；选择性和固定相选择以及pH条件有关，通过选择合适的色谱柱和合适的pH，可以提高选择性；有时候适当延长出峰时间增加保留因子，也可提高分离度。

18、苯基柱，氰基柱该什么时候考虑用？

答：苯基柱用于含苯环的芳香族化合物的测定时，具有较高的选择性。CN柱可作为一个保留能力最弱的反相柱使用，也可作为一个活性降低的正相柱使用（保留时间比硅胶柱和氨基柱低很多）。

19、同样类型柱子还有长度，粒径等差异，这些该怎么去选择？

答：长度和粒径都是用来改变柱效的，选择原则是够用就好。

20、我前几天刚刚装上一个新的C18柱，在进样之前我用100%的甲醇冲了半个多小时。刚才看到上面写的要活化什么的？不知道我只冲洗半小时就开始用对柱子有没有影响？对出峰什么的有没有影响呢？

答：不是所有的测定，都需要对新柱子用所测样品老化。但先按方法程序进样几针，观察到峰面积保留时间不再有明显变化，再开始正式测定，这是一个好习惯。按你现在的做法，如果第一针和第二针的峰面积、保留时间没有变化，就继续做没影响吧。

21、现在色谱柱和仪器的接口还没有标准化吗，除了检测池的出入管较小外，色谱柱的接口与ＰＥＥＫ头不匹配的有哪个型号的色谱柱，以后使用的时候需要注意一点。同时发现使用过金属接头的色谱柱再换成ＰＥＥＫ头，常易漏液，这是因为金属头易使色谱柱接口变形吗？

答：色谱柱接头其实大都不是色谱柱厂商自己生产的，供货商有多个，VICI，Upchurch，Parker等，他们的标准相互之间不统一，那色谱柱接头的标准就统一不起来。不过一般这个问题也不难解决的，换个接头就可以了，而且现在有了万用接头，可以配所有不同类型的柱头，不泄露，连接死体积又很小。

22、普通的C18柱能作为正相色谱柱使用吗？正相色谱体系中最常用也最普通的是那种色谱柱。正相柱在使用过程中与反向柱相比有什么需要注意的地方？

答：普通C18柱作为正相柱使用，我还没听说过。正相色谱分离模式是指固定相的极性比流动相的极性大，反过来，流动相极性大就是反相。C18固定相属于疏水性相对比较强的，疏水性强就是极性很弱，应该找不出极性比它更弱的流动相了。

正相体系常见的柱子有：硅胶柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱，最普通的应该就是硅胶柱。正相柱和反相柱比，最需要注意的是水分，正相柱对水分非常敏感，流动相中水分含量的些微变化对保留时间影响很大，因此正相柱测定前平衡时间需要几个小时甚至更长。

23、色谱柱的柱头类型与不锈钢毛细管接头有6种连接方式（在讲义里面提到），那么我们用户一般是液相色谱仪是固定某一个厂家，而是根据样品检测需要更换不同类型的色谱柱，那么怎么判断我所购买的色谱柱是否与不锈钢毛细管是否匹配呢，我之前只是知道安捷伦和waters都有规定他们自己家的柱子与自己家的仪器配套是最合适的，而其他厂家的色谱柱都很少提及，在不知道的情况下，我们该怎么选择？月旭的色谱柱柱头类型属于哪一种类型呢？

答：不锈钢毛细管接头有个缺点，用过一次后卡匝位置和距离毛细管末端的长度就固定死了。如果下次用的色谱柱的柱头接口深度和原来的不同，就容易产生死体积和泄漏。产生的死体积一般不大，如果只引起柱效的稍微下降而没引起拖尾，这个问题就容易被忽略。引起大家关注的是泄漏，如果用了新柱子，发现和毛细管的接口处有泄漏，就可以判断是接头的匹配问题。最好的判断方法还是：询问一下厂商色谱柱柱头的类型和柱头接口的深度，然后和毛细管接头的规格比较。

如果用PEEK接头，发生问题的情况就大大减少，因为PEEK接头卡匝位置是不固定的。

接头与色谱柱的匹配，并没有在实际色谱应用中造成很大的问题，有很多人都没有关注到这个问题。一方面原因是使用PEEK接头的情况很普遍，另外如果发现不匹配，换个毛细管接头还是非常方便的。

24、相对于气相色谱，液相的优势在哪里？做防腐剂分析时，流动相加入乙酸铵才可以出峰，原理是什么？

答：液相和气相相比的优势有很多,我认为主要在于应用范围更广。气相只限于容易气化的低分子量物质的分析测定，对象大部分是基础化工原材料；而任何能溶解于某溶剂的物质都能用液相分析，适用对象是分子量从几十到几万的广大范围。在制药、化工、环保、食品和刑侦等诸多重要领域，液相都已成为主导的分析分离工具。也有两者都能应用的交叉情况，但液相的制样更简单。液相色谱的出现克服了气相色谱不能直接用于难挥发、热不稳定及高分子化合物的弱点。

25、您提到“磷酸盐缓冲盐渗透力强，有加快硅胶溶解的副作用，它的存在会降低pH使用范围。”，既然这样，经常使用，柱子寿命是否也下降的快呀？

答：经常用磷酸盐，在其它条件差不多一样的情况下，柱子寿命肯定比不用磷酸缓冲盐相对短一些。但用磷酸盐也有不可取代的优点吧，否则不可能现在大部分人还在用。

26、CN柱的保存需要在低温条件，但是又不能太低，使固定相冻结，怎么控制这个温度？怎么判断固定相是否被冻结？固定相冻结后会是什么样的现象？

答：所谓低温储存，就是放到阴凉处或者放到冰箱的冷藏室。储存液只要不是纯水，冰点都比较低，纯甲醇的冰点是零下90度以下了。

27、我们测试样品时，经常会关心柱压是否太高，但是在购买色谱柱时，并没有说每一根色谱柱的最大使用压力是多少？针对这样的情况，用户怎么判断柱压是否超过该柱的极限？

答：装柱时的压力比使用时高很多，所以柱压对色谱柱本身在使用时没有极限问题存在，倒是一般仪器有个40Mpa的上限。如果色谱分离度还能满足分析方法要求，柱压只要仪器能承受就OK吧。

28、使用缓冲液不当，使硅胶溶解并重新形成粉末后，会出现什么样的异常情况？怎么处理？

答：出现异常就是柱压升高。小粉末在流动相不断冲洗带动下，最后会聚集在柱子出口端，沉积在后筛板。处理方法只有拆下后筛板进行清洗或更换，但这样做会影响到柱床，处理后柱效会下降。

29、今天才知道滤膜的材质分了这么几种：再生纤维素、聚四氟乙烯、硝酸纤维和醋酸纤维等，之前只知道有有机系和水系之分？各种不同材质的滤膜适合于什么样的样品？

答：再生纤维素膜：具有蛋白质吸收低，适用于水溶性样品和有机溶剂；

聚四氟乙烯：适用于所有有机溶剂，酸和盐；

尼龙66：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%的乙醇，二氯甲烷，不适用与二甲基甲酰胺；

醋酸纤维：不适用有机溶剂，特别适用水基溶液。

30、常规LC的柱子粒度小，柱效高，现在有3.5um的常规柱，不知道用3.5um*250的压力与4.6um的压力相差多少？

答：一般柱子4.6mmx250mm指的是其内径和长度。粒径才用um的单位，但一般标的是5um，也有3.5um的。其它条件一样，光粒径是3.5um和5um的柱压差别，理论上3.5um柱子的柱压是5um柱子的(5/3.5)平方倍数，即2.04倍，简单说就是2倍。

31、我对聚苯乙烯-二乙烯苯柱很有兴趣，主要是它耐高温、耐酸碱、但有关这方面的文献很少，但对于他的分离效能我一直心里没底，我的问题有三：1、分离效果与ODS比较，是相当呢，还是更胜一筹，或是更差？2、我原以为它是整体住，但看过资料后发现也是颗粒的比如5u，请问该类型的柱是否符合速率理论、是不是粒径越小分离效果会几何级的增加？3、问什么没有1.7u的这种柱出现呢？

32、“样品与离子对生成紧密的结合物，离子对试剂掩藏化合物中的极性基团”这句话是什么意思？离子对怎么样掩蔽化合物中极性基团？不就是通过静电引力的作用形成离子缔合物，来降低其极性的吗？

答：离子对色谱是解决强极性物质在反相色谱中保留能力不足的一个有效的途径。有些碱性极性物质，即使用100%水相做流动相，且无论在色谱柱能承受的pH范围内怎么去调节pH，保留能力都不够。如果需要分离的组分中全是可以离子态存在的，那还可以选择离子交换色谱进行分离。不然的话，就只有选择离子对色谱方法了，尽管它有流传的那么多副作用存在。

离子对试剂含亲水基和疏水基，很像表面活性剂，所以一开始离子对色谱也称为“皂色谱”。离子对作用的机理有两种解释，你上面都已经提到了。到底是哪种解释对，尚无定论，实际上也没必要去定论，反正两种解释都通就可以了。主流的解释也是你先提到的机理，下面示意图更直观：

我个人认为，两种机理都可能存在，要看离子对试剂、固定相和分析物这三者本身情况而定。如果离子对试剂的疏水端和固定相之间的结合力相对更强，示意图的作用机理会占上风。反之，离子对试剂亲水端和分析物导致掩藏极性端的作用力更强，你后面提到的机理更可能。总之，要看你用的什么离子对试剂，是何种的分析物等具体情况不同而不同吧。

33、我们在用的氨基柱时，有时候峰型突然变宽，有拖尾，用一段时间就又好了，不明白是什么原因造成的，如果要再生氨基柱的时候应该怎么做呢？是像您先前回答的问题中提到的，用一定比例的氨水冲洗吗？氨基柱可以直接用纯水冲洗吗？记得当时买的氨基柱那个使用说明书上说不能用纯水冲？是这样的吗？如果可以冲的话，一般冲多久？

答：氨基柱的硅胶孔内的氨基浓度非常高（大约有1mol/L），在有水存在的时候，在孔内形成一个pH10左右甚至超过10的很强的碱性小环境，并会导致硅胶基体慢慢溶解。不过硅胶基体的溶解会生成酸性的硅醇基，又会降低孔内的pH值，延缓硅胶基体的溶解进程。一段时间后，两个相反的过程会达成一个动态平衡，从而稳定下来。对你问题提到的这个现象，我想到的是这个原因。

氨基柱，要看氨基柱的应用模式，是正相还是HILIC？这两种模式的情况是大不相同的。正相使用，一般很怕有水。但HILIC模式应用，一般流动相是乙腈/水，是不怕水的。不过键合氨丙基基团非常容易水解，所以一般氨基柱不适宜保存有水的溶剂中。作为正相应用时，流动相中要求一点都不能含水，但清洗柱子上的污染物质，是可以含水的，因为水有强极性，在正相色谱上洗脱能力极强，当然不必用100%纯水。氨基柱具体冲洗方法，正相条件按照正相硅胶柱的清洗方法，HILIC模式按C18柱的清洗方法。