第二，在反相色谱分析中通常不要求化合物精确的pKa值，我们可以根据一些已知数据进行预测。对于一些典型的化学物，我们应该熟知它们的pKa。最常见的脂肪族羧酸pKa值约为5，比如布洛芬的pKa为5.2；典型的胺类化合物的pKa约为9，比如阿米替林的pKa是9.4。这样在分析一些酸碱性的问题时就可以信手拈来，方便快捷。根据化合物的结构按照下图中列出的主要酸碱官能团在水溶液的pKa值进行推测。

3、根据流动相pH值测定所需要的缓冲盐

1.缓冲液选择主要依据：

（1）缓冲溶液的pKa和缓冲容量

（2）溶解度

（3）紫外吸收

2.对以上三点进行说明

(1)一般缓冲溶液的pKa值与流动相的pH相等时缓冲能力最大，pKa与流动相的pH相差越大，缓冲液的缓冲能力越差。一般要求流动相的pH与缓冲液的pKa值不能超过±1.0个单位，当缓冲溶液浓度较高时可以放宽范围到1.5个单位。常用的缓冲液的缓冲范围见下图：

缓冲溶液的浓度一般在5-50mmol，因过低导致缓冲能力不足（可通过调整进样体积查看化合物峰型的变化，如果出现拖尾或者前沿现象，说明缓冲溶液的能力不足）；缓冲液浓度过大会导致与有机相混溶时盐的析出，对仪器、色谱柱都会产生损伤，而且使得基线不好。一般初始摸索方法时推荐使用25mmol。

（2）根据缓冲液溶解度：在酸性缓冲溶液中，如磷酸盐，缓冲液溶解度顺序：钠盐＜钾盐＜铵盐；有研究发现，当pH=7时10mmol的磷酸钾在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3时，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此测试通过使用容器将不同比例的混合溶剂进行混合，观察大约30min，是否有沉淀产生，否则就要降低缓冲液的浓度或者有机相的含量，在梯度洗脱时尤为注意）。

（3）根据化合物的吸收波长：在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸盐缓冲液是不错的选择。而甲酸盐和乙酸盐缓冲液的范围是2.5～6.0，适用于210nm或者更高吸收的检测波长。

3. 缓冲盐的作用：

缓冲液的作用主要有两个方面：

（1）缓冲分析物，使其保持在所需的pH值处。由于在实际分析工作中，色谱柱上的样品质量非常少，因此仅需要很少的缓冲液就能为样品提供足够的缓冲。如果样品与流动相的pH值相差大，且进样量太大，建议在进样前先调节样品溶液至接近流动相pH值。

（2）缓冲色谱柱，使其保持恒定的pH值。由于大量的缓冲流动相通过色谱柱，所以固定相不断暴露在缓冲液中。随着现在商品化的硅胶基质色谱柱纯度的提高，硅胶上的酸性硅醇基团的含量也越来越低，因此所需的缓冲液也越来越少。下图是高纯、中等纯和低纯硅胶的柱子在添加0.1%和增加0.01%TFA时分析图谱对比：

4. 常用缓冲盐点评

磷酸盐：是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一，因为它可以在低于220 nm的波长下使用。磷酸盐具有三个pKa值，可提供pH 1.1-3.1，6.2-8.2，11.3-13.3三个缓冲范围。虽然它使用广泛，但是也要注意它的溶解度问题，防止高浓度条件下在HPLC泵或者色谱柱中析出。

醋酸盐：也是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一，可以在高于220 nm的波长下使用。它可以提供pH 3.8-5.8的缓冲范围，因此它刚好填补了磷酸盐在pH 2.0-8.0之间的缺口。

因此磷酸盐和醋酸盐的配合使用可以满足通常用于硅胶基质色谱柱的整个pH范围。

三氟乙酸：0.1%的三氟乙酸能产生pH≈2的流动相，多年来它一直是低pH条件下LC-MS的首选添加剂，但是TFA能够抑制电离，导致信号下降。TFA也可作为离子对试剂，广泛用于蛋白和多肽类的分析。

甲酸：0.1%的甲酸能产生pH≈2.7的流动相，已经成为低pH条件下LC-MS的首选。

根据以上的理论，流动相缓冲容量取决于缓冲盐的pka，缓冲盐浓度，流动相pH。

当缓冲液中溶质的的两种形态（HA和 A-）浓度相等时，即缓冲盐的pka与流动相pH相等时，缓冲能力最大。当流动相的pH与缓冲盐的pka相差越大，缓冲盐的缓冲容量就越小。因此缓冲的pka与流动相的pH相差不能超过±1.0个单位。

流动相的缓冲容量一般与缓冲液浓度成正比关系，通常浓度范围为5~25mmol/l。

样品溶解在流动相中可以避免在反相色谱过程中发生缓冲能力的问题，尤其是流动相缓冲液浓度较低或注入样品量较大的时候尤为重要。

当缓冲容量偏低时，可以从以下方面调节缓冲容量：

1、减少缓冲液pKa与流动相pH之间的差异（可调节pH或更换缓冲液）

2、矿大流动相pH和溶质pKa之间的差异（当差异足够大时，溶质倍完全离子化或者保持非离子化形式此时缓冲液显的不重要了）

3、增加缓冲液浓度

4、减少样品进样体积

5、调节样品的pH与流动相的一致。