一、验证目的

本验证方案的目的是为了判断所采用分析方法是否科学、合理，能否有效的检测注射用中基因毒性杂质氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷的含量。参考注射用说明书，其规格为75mg，每日最大用量为150mg。根据ICH M7，氯甲烷和氯乙烷的终身AI值分别为1361μg/天、1810μg/天，经计算氯甲烷、氯乙烷的限度分别为1361μg/150mg=0.9%、1810μg/150mg=1.2%，据此计算的限度过高，因此按照注射用自拟标准单个杂质的限度0.2%制定这两个基毒的限度。另2-氯丙烷无充分的毒性数据，故参照比它毒性更强的1,2-二氯丙烷的毒性数据（CPDB数据库），TD₅₀=276mg/kg/day，PDE=276μg/day计算2-氯丙烷的限度为276μg/150mg=0.18%。根据上述各杂质限度的要求，对上述3个杂质的检测方法进行验证，验证内容包括系统适用性、专属性、检测限、定量限、线性及范围、准确度、精密度（重复性和中间精密度）、溶液稳定性和耐用性。

二、验证的方法

1. 仪器及参数

表1：仪器信息

表2：色谱条件

2. 试验材料

表3：试剂信息

表4：对照品信息

表5：样品信息

3. 溶液配制

稀释剂： N，N-二甲基乙酰胺：水=1:1；

空白溶液：精密移取 1.0ml稀释剂，置20ml顶空瓶，密封，即得；

2-氯丙烷贮备液：取2-氯丙烷约0.018g，精密称定，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；（每1ml中约含2-氯丙烷360μg）

对照品贮备液：精密移取2-氯丙烷贮备液75μl、氯甲烷和氯乙烷各300μl，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；（每1ml中约含氯甲烷1.5μg、氯乙烷1.5μg、2-氯丙烷各1.35μg）

对照品溶液：精密移取1.0ml对照品贮备液，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液1.0ml，置20ml顶空瓶，密封，即得；（每1ml中约含氯甲烷75ng、氯乙烷75ng、2-氯丙烷各67.5ng）

空白辅料贮备液：取空白辅料约0.015g，精密称定，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

空白辅料溶液：精密移取空白辅料贮备液1.0ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液1.0ml，置20ml顶空瓶中，密封，即得；

供试品贮备液：取供试品约0.030g，精密称定，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

供试品溶液：精密移取供试品贮备液1.0ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液1.0ml，置20ml顶空瓶中，密封，即得。（每1ml中约含37.5μg）

4. 进样程序及系统适用性要求 

表6：进样程序及系统适用性要求

5. 计算公式

按外标法以峰面积计算供试品中氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷的含量：

式中：

f—各杂质对照品的响应因子，ng/ml；

m₁—各杂质对照品的称样量，g；

ρ—各杂质对照品的含量，%；

m₂—供试品的称样量，g； 

P—供试品的平均装量，g； 

C—供试品的规格，75mg；

V₁—对照品溶液的稀释体积，ml；

V₂—供试品溶液的稀释体积，ml；

A₁—对照品溶液中各杂质的峰面积；

A₂—供试品溶液中各杂质的峰面积。

6. 可接受标准

供试品中，含氯甲烷、氯乙烷应不得过0.2%，2-氯丙烷应不得过0.18%。

三、验证内容

1. 系统适用性

1.1溶液配制

空白溶液、对照品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制。

1.2进样程序

空白溶液分析1次，对照品溶液1分析5次，对照品溶液2分析2次。

1.3可接受标准

连续分析5次对照品溶液，各杂质峰面积的RSD值应不得过10.0%，保留时间的RSD值应不得过1.0%；7针对照品溶液各杂质f值的RSD值应不得过10.0%。

2. 专属性

2.1溶液配制

空白溶液、空白辅料溶液、对照品贮备液、对照品溶液、供试品贮备液、供试品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

供试品加标溶液（100%限度水平）：精密移取1.0ml供试品贮备液和1.0ml对照品贮备液，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液1.0ml，置20ml顶空瓶中，密封，即得。

2.2进样程序

空白溶液、空白辅料溶液、供试品溶液、对照品溶液、供试品加标溶液各分析1次。

2.3可接受标准

空白溶液和空白辅料溶液对各杂质的测定无干扰；对照品溶液色谱图中，各杂质峰与相邻峰之间的分离度应符合要求；供试品加标溶液色谱图中，各杂质峰与相邻峰之间的分离度应符合要求，各杂质峰保留时间与对照品溶液色谱图中相应峰的保留时间一致。

3. 检测限和定量限

3.1概述

以限度浓度的5%浓度水平作为方法的检测限，考察其信噪比是否符合要求。以限度浓度的20%浓度水平作为方法的定量限，考察其信噪比及重复性是否符合要求。

3.2溶液配制

对照品贮备液、对照品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制。

检测限溶液（5%）：精密量取对照品溶液1.0ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得，精密移取1.0ml上述溶液，置20ml顶空瓶，密封，即得；配制1份。

定量限溶液（20%）：精密量取对照品贮备液200μl，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得，精密移取1.0ml上述溶液，置20ml顶空瓶，密封，即得；配制6份。

3.3进样程序

检测限溶液分析3次、6份定量限溶液各分析1次。

3.4可接受标准

检测限溶液色谱图中，各杂质峰的信噪比应不得小于3。

定量限溶液色谱图中，各杂质峰的信噪比应不得小于10；峰面积的RSD值应不得过15.0%。

4. 线性及范围

4.1概述

在限度浓度（100%）的上下取5个比较均匀的浓度点（20%、50%、100%、150%、200%）进样分析，以各杂质的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。

4.2溶液配制

对照品贮备液、对照品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

各线性贮备液的配制见下表7。

表7：线性贮备液配制

4.3进样程序

将5个线性贮备液各精密移取1.0ml，分别置5个20ml顶空瓶中，密封，即得，5个线性溶液各分析1次。

4.4计算方式

以各个线性溶液中各杂质的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，做线性回归方程，报告线性曲线的斜率、截距和相关系数r。

4.5可接受标准

线性回归方程的相关系数r≥0.990，Y轴截距不得大于100%浓度响应因子的0.25倍。

5. 精密度（重复性）

5.1概述

由同一试验人员配制2份供试品溶液、6份供试品加标溶液，进行供试品加标溶液重复性测试，计算6份供试品加标溶液中各杂质的回收率及回收率RSD值。

5.2溶液配制

空白溶液、空白辅料溶液、对照品贮备液、对照品溶液、供试品贮备液、供试品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

重复性溶液：精密移取1.0ml供试品贮备液和1.0ml对照品贮备液，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液1.0ml，置20ml顶空瓶中，密封，即得。平行配制6份。

5.3进样程序

空白溶液分析1次、空白辅料溶液分析1次、对照品溶液1分析5次、对照品溶液2分析2次、2份供试品溶液各分析1次、6份重复性溶液各分析1次。

5.4可接受标准

6份重复性溶液中，各杂质的回收率应在80%～120%之间，回收率的RSD值应不得过10.0%。

6. 精密度（中间精密度）

6.1概述

由不同的试验人员，于不同日期，配制6份供试品加标溶液（100%限度水平），进行供试品加标溶液中间精密度测试。

6.2溶液配制

空白溶液、空白辅料溶液、2-氯丙烷贮备液、对照品贮备液、对照品溶液、供试品贮备液、供试品溶液等同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

中间精密度溶液同“5.精密度（重复性）”项下“重复性溶液”的方法配制，平行配制6份。

6.3进样程序

空白溶液分析1次、空白辅料溶液分析1次、对照品溶液1分析5次、对照品溶液2分析2次、2份供试品溶液各分析1次、6份中间精密度溶液各分析1次。

6.4可接受标准

6份中间精密度溶液中，各杂质的回收率应在80%～120%之间，回收率的RSD值应不得过10.0%。与重复性6次结果，共12次供试品加标溶液中各杂质回收率的RSD值应不得过15.0%。

7. 准确度

7.1概述

准确度是通过回收率来反映。通过在供试品溶液中加入指标浓度的50%、100%、150%三个不同浓度，每个浓度平行制备3份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9份回收率数据的相对标准偏差（RSD）。

7.2溶液配制

空白溶液、空白辅料溶液、对照品贮备液、对照品溶液、供试品贮备液、供试品溶液等同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

准确度溶液1（50%）：精密移取1.0ml供试品贮备液和0.5ml对照品贮备液，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液1.0ml，置20ml顶空瓶中，密封，即得，平行配制3份；

准确度溶液2（100%）：精密移取1.0ml供试品贮备液和1.0ml对照品贮备液，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液1.0ml，置20ml顶空瓶中，密封，即得，平行配制3份；

准确度溶液3（150%）：精密移取1.0ml供试品贮备液和1.5ml对照品贮备液，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液1.0ml，置20ml顶空瓶中，密封，即得，平行配制3份。

7.3进样程序

空白溶液分析1次、空白辅料溶液分析1次、对照品溶液1分析5次、对照品溶液2分析2次、2份供试品溶液各分析1次、9份准确度溶液各分析1次。

7.4计算公式

式中：

f—各杂质对照品的响应因子，ng/ml；

C₁—各杂质对照品溶液的配制浓度，ng/ml；

C₂—各准确度溶液中供试品的浓度，mg/ml；

C₃—供试品溶液中供试品的浓度，mg/ml；

A₁—各准确度溶液中各杂质的峰面积；

A₂—供试品溶液中各杂质的峰面积。

7.5可接受标准

9份准确度溶液中，各杂质的回收率应在80%～120%之间，回收率的RSD值应不得过15.0%。

8. 溶液稳定性

8.1概述

取对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液，室温放置，分别于不同时间点取样检测，考察对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液在室温条件下的稳定性。

8.2溶液配制

对照品溶液、供试品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制；

供试品加标溶液同“2.专属性”项下“供试品加标溶液”的方法配制。

8.3进样程序

在各个时间点取对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液各分析1次。

8.4可接受标准

对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液，各时间点检测结果与0小时比较各杂质峰面积的比值应为80%～120%。（备注：供试品溶液中检测得到的各杂质峰峰面积如均低于检测限的峰面积，可直接判定为溶液稳定）

9. 耐用性

9.1概述

考察在色谱条件有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于日常检验提供依据，对对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液进行分析，考察系统适用性和回收率是否符合要求，各耐用性色谱条件见下表8。

表8：耐用性色谱条件

9.2溶液配制

空白溶液、空白辅料溶液、对照品溶液、供试品溶液同“二、验证的方法”项下“3.溶液配制”的方法配制。

供试品加标溶液同“2.专属性”项下“供试品加标溶液”的方法配制。

9.3进样程序

各耐用性实验条件下，空白溶液分析1次，空白辅料溶液分析1次、对照品溶液1分析5次、对照品溶液2分析2次、供试品溶液分析1次、供试品加标溶液分析1次。

9.4可接受标准

在各种不同的耐用性实验条件下，系统适用性应符合要求，各杂质的回收率应在80%～120%之间，回收率的RSD值应不得过15.0%。

四、样品检验

按照“二、验证的方法”项下所述方法，对注射用中氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷的含量进行测定，记录色谱图，根据“二、验证的方法”项下计算公式计算各批供试品中氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷的含量。